5 Trasformazione dei dati

5.1 Grafico Media/Deviazione standard

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meanSdPlot(assay(dds), ranks = FALSE)

Un grafico Media/DS (Deviazione Standard) è uno strumento utile per valutare l’efficacia dei metodi di normalizzazione dell’abbondanza genica, specialmente nell’analisi dei dati RNA-Seq. Ecco come funziona:

1. Le basi

Media: Il livello di espressione medio di un gene in tutti i campioni del tuo set di dati.
Deviazione Standard (DS): Una misura di quanto varia l’espressione di un gene tra i tuoi campioni.

2. Costruire il grafico

Asse X: L’abbondanza media del gene (di solito su una scala logaritmica).
Asse Y: La deviazione standard dell’abbondanza del gene (anche spesso trasformata logaritmicamente).
Ogni punto: Rappresenta un singolo gene nel tuo set di dati.

3. Interpretazione

Scenario ideale: Dopo una normalizzazione efficace, idealmente dovresti vedere una linea orizzontale o una tendenza relativamente piatta nel grafico. Ciò indica che la deviazione standard (variabilità) dell’espressione genica è coerente tra i diversi livelli di espressione media.
Problemi di normalizzazione: Se vedi una forte tendenza (ad esempio, una forma a imbuto in cui la DS aumenta con la media), suggerisce che il tuo metodo di normalizzazione non ha completamente tenuto conto di bias sistematici. Questi bias potrebbero essere dovuti a:
- Differenze nella dimensione della libreria: I campioni con più letture tendono ad avere una varianza maggiore.
- Bias della lunghezza del gene: I geni più lunghi tendono ad avere più letture e quindi una maggiore varianza.
- Bias del contenuto di GC: I geni con diverso contenuto di GC possono essere influenzati in modo diverso durante la preparazione della libreria.

4. Perché è importante

Analisi accurata dell’espressione differenziale: La normalizzazione mira a ridurre questi bias tecnici in modo da poter identificare con sicurezza le vere differenze biologiche nell’espressione genica tra i gruppi (ad esempio, trattato vs. controllo). Un grafico Media/DS ti aiuta a vedere se il metodo scelto raggiunge questo obiettivo.
Confronto tra metodi di normalizzazione: Puoi utilizzare i grafici Media/DS per confrontare le prestazioni di diverse tecniche di normalizzazione sui tuoi dati e scegliere quella che stabilizza meglio la varianza.

Esempio:

Immagina un grafico Media/DS in cui la deviazione standard è molto più alta per i geni con espressione media elevata. Ciò suggerisce un bias correlato alla profondità di sequenziamento o alla lunghezza del gene. Un buon metodo di normalizzazione dovrebbe ridurre questa tendenza, portando a una distribuzione più uniforme delle deviazioni standard su tutti i livelli di espressione.

In sintesi: Il grafico Media/DS è uno strumento diagnostico visivo che ti aiuta a valutare la qualità della normalizzazione dell’abbondanza genica. È un passaggio chiave per garantire l’accuratezza e l’affidabilità delle analisi a valle come l’espressione genica differenziale.

5.2 Trasformazione

Per stabilizzare la varianza e rendere i dati più adatti alle assunzioni del modello statistico, possiamo applicare trasformazioni come la Variance Stabilizing Transformation (VST) o la Regularized Log Transformation (rlog). La scelta della trasformazione dipenderà dalle caratteristiche dei dati e dagli obiettivi dell’analisi.

5.3 VST vs. rlog

Sia la VST (Variance Stabilizing Transformation) che la rlog (Regularized Log Transformation) mirano a trasformare i dati di conteggio per stabilizzare la varianza tra i geni con diversa espressione.

5.3.1 Quando scegliere VST?

Analisi di Espressione Differenziale: La VST è generalmente preferita per l’analisi dell’espressione differenziale, poiché è stata specificamente progettata per questo scopo.
Visualizzazione di Heatmap e PCA: La VST è adatta per visualizzare i dati in heatmap e PCA, in quanto preserva bene le distanze tra i campioni.
Dataset di Grandi Dimensioni: La VST è computazionalmente più efficiente della rlog, quindi è preferibile per dataset con molti geni o campioni.

5.3.2 Quando scegliere rlog?

Esplorazione dei Dati: La rlog può essere utile per esplorare i dati in modo più intuitivo, poiché produce valori che sono più simili ai log2 fold change.
Clustering: La rlog può essere preferita per il clustering dei geni, poiché tende a separare meglio i cluster.
Dataset di Piccole Dimensioni: La rlog può essere più accurata della VST per dataset con pochi geni o campioni.

5.3.3 VST

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vst <- DESeq2::vst(dds, blind = TRUE)
saveRDS(vst, "data/vst.rds")
meanSdPlot(assay(vst), ranks = FALSE)

5.3.4 rlog

Mostra il codice R

rlog <- DESeq2::rlog(dds, blind = TRUE)
meanSdPlot(assay(rlog), ranks = FALSE)

--- params: mycondition: infection mynum: InfluenzaA mydenom: NonInfected mypval: 0.01 myfc: 0.8 mypadj: fdr --- ```{r} #| echo: false #| message: false #| warning: false source("_common.R") library(tidyverse) library(DESeq2) # BioC library(RColorBrewer) library(pheatmap) library(ggrepel) library(cowplot) library(DT) library(scales) library(vsn) # BioC library(apeglm) # BioC library(rmarkdown) library(gt) readcounts <- readRDS("data/readcounts.rds") coldata <- readRDS("data/coldata.rds") dds <- readRDS("data/dds_fitered.rds") ``` # Trasformazione dei dati {#sec-preproc-trans} ## Grafico Media/Deviazione standard ```{r} #| out-width: 100% meanSdPlot(assay(dds), ranks = FALSE) ``` ::: {.content-hidden when-meta="features.advanced_analysis"} Un grafico Media/DS (Deviazione Standard) è uno strumento utile per valutare l'efficacia dei metodi di normalizzazione dell'abbondanza genica, specialmente nell'analisi dei dati RNA-Seq. Ecco come funziona: **1. Le basi** - **Media:** Il livello di espressione medio di un gene in tutti i campioni del tuo set di dati. - **Deviazione Standard (DS):** Una misura di quanto varia l'espressione di un gene tra i tuoi campioni. **2. Costruire il grafico** - **Asse X:** L'abbondanza media del gene (di solito su una scala logaritmica). - **Asse Y:** La deviazione standard dell'abbondanza del gene (anche spesso trasformata logaritmicamente). - **Ogni punto:** Rappresenta un singolo gene nel tuo set di dati. **3. Interpretazione** - **Scenario ideale:** Dopo una normalizzazione efficace, idealmente dovresti vedere una linea orizzontale o una tendenza relativamente piatta nel grafico. Ciò indica che la deviazione standard (variabilità) dell'espressione genica è coerente tra i diversi livelli di espressione media. - **Problemi di normalizzazione:** Se vedi una forte tendenza (ad esempio, una forma a imbuto in cui la DS aumenta con la media), suggerisce che il tuo metodo di normalizzazione non ha completamente tenuto conto di bias sistematici. Questi bias potrebbero essere dovuti a: - **Differenze nella dimensione della libreria:** I campioni con più letture tendono ad avere una varianza maggiore. - **Bias della lunghezza del gene:** I geni più lunghi tendono ad avere più letture e quindi una maggiore varianza. - **Bias del contenuto di GC:** I geni con diverso contenuto di GC possono essere influenzati in modo diverso durante la preparazione della libreria. **4. Perché è importante** - **Analisi accurata dell'espressione differenziale:** La normalizzazione mira a ridurre questi bias tecnici in modo da poter identificare con sicurezza le vere differenze biologiche nell'espressione genica tra i gruppi (ad esempio, trattato vs. controllo). Un grafico Media/DS ti aiuta a vedere se il metodo scelto raggiunge questo obiettivo. - **Confronto tra metodi di normalizzazione:** Puoi utilizzare i grafici Media/DS per confrontare le prestazioni di diverse tecniche di normalizzazione sui tuoi dati e scegliere quella che stabilizza meglio la varianza. **Esempio:** Immagina un grafico Media/DS in cui la deviazione standard è molto più alta per i geni con espressione media elevata. Ciò suggerisce un bias correlato alla profondità di sequenziamento o alla lunghezza del gene. Un buon metodo di normalizzazione dovrebbe ridurre questa tendenza, portando a una distribuzione più uniforme delle deviazioni standard su tutti i livelli di espressione. **In sintesi:** Il grafico Media/DS è uno strumento diagnostico visivo che ti aiuta a valutare la qualità della normalizzazione dell'abbondanza genica. È un passaggio chiave per garantire l'accuratezza e l'affidabilità delle analisi a valle come l'espressione genica differenziale. ::: ## Trasformazione Per stabilizzare la varianza e rendere i dati più adatti alle assunzioni del modello statistico, possiamo applicare trasformazioni come la Variance Stabilizing Transformation (VST) o la Regularized Log Transformation (rlog). La scelta della trasformazione dipenderà dalle caratteristiche dei dati e dagli obiettivi dell’analisi. ::: {.content-hidden when-meta="features.advanced_analysis"} ## VST vs. rlog Sia la VST (Variance Stabilizing Transformation) che la rlog (Regularized Log Transformation) mirano a trasformare i dati di conteggio per stabilizzare la varianza tra i geni con diversa espressione. ### Quando scegliere VST? - **Analisi di Espressione Differenziale**: La VST è generalmente preferita per l’analisi dell’espressione differenziale, poiché è stata specificamente progettata per questo scopo. - **Visualizzazione di Heatmap e PCA**: La VST è adatta per visualizzare i dati in heatmap e PCA, in quanto preserva bene le distanze tra i campioni. - **Dataset di Grandi Dimensioni**: La VST è computazionalmente più efficiente della rlog, quindi è preferibile per dataset con molti geni o campioni. ### Quando scegliere rlog? - **Esplorazione dei Dati**: La rlog può essere utile per esplorare i dati in modo più intuitivo, poiché produce valori che sono più simili ai log2 fold change. - **Clustering**: La rlog può essere preferita per il clustering dei geni, poiché tende a separare meglio i cluster. - **Dataset di Piccole Dimensioni**: La rlog può essere più accurata della VST per dataset con pochi geni o campioni. ::: ### VST ```{r} #| out-width: 100% vst <- DESeq2::vst(dds, blind = TRUE) saveRDS(vst, "data/vst.rds") meanSdPlot(assay(vst), ranks = FALSE) ``` ### rlog ```{r} #| out-width: 100% rlog <- DESeq2::rlog(dds, blind = TRUE) meanSdPlot(assay(rlog), ranks = FALSE) ```